Pechowy marzyciel Larry Daley, którego niestworzone idee nigdy nie zaprocentowały, pilnie potrzebuje pracy. Zrezygnowany przyjmuje mało ambitną posadę stróża nocnego w Muzeum Historii Naturalnej. Podczas pierwszej zmiany Larry odkrywa magiczną moc tablicy Ahkmenraha, która sprawia, że nocą ożywają zgromadzone w muzeum eksponaty, a wśród nich: Theodore Roosevelt, Tyranozaur (zwany Reksio), Dexter (małpka kapucynka), Głowa z Wyspy Wielkanocnej oraz Faraon Ahkmenrah, wypchane zwierzęta prehistoryczne, miniatury ukazujące wielkie bitwy historii i figury przedstawiające słynne postacie historyczne, które wprowadzają w muzeum spore zamieszanie. Larry musi zrobić wszystko, aby odzyskać kontrolę nad muzeum. W obliczu groźby utraty pracy i kolejnego zawodu uczynionego swemu synowi Nickowi, Larry decyduje się stoczyć bitwę z byłymi strażnikami którzy próbują ukraść tablice ożywiającą eksponaty, mając nadzieję, że wreszcie okaże się tak wspaniałym ojcem, jakim zawsze chciał być.

Kontynuacja: Noc w muzeum 2 (Night at the Museum: Battle of the Smithsonian) [2009]