Assassin's Creed: Brotherhood kontynuuje wątki zapoczątkowane w Assassin's Creed II. Ezio zrealizował powierzone mu zadanie i dokonał zemsty na osobach odpowiedzialnych za śmierć najbliższych. Sielanka nie trwała jednak długo – Monterrigioni, które stało się dla niego nowym domem, zostało zaatakowane i doszczętnie zniszczone przez Cezara Borgię – syna antagonisty z poprzedniej części gry. Jakby tego było mało, Cezar morduje wuja protagonisty, a jego samego po raz kolejny zmusza do ucieczki. W ten oto sposób nasz podopieczny wraz z matką i siostrą trafia do Rzymu, czyli stolicy ówczesnej kultury, a także miejsca politycznych gierek, intryg i wojenek rozgrywanych pomiędzy trzęsącymi metropolią rodami. Zadaniem, jakie stoi przed bohaterem, jest przede wszystkim zniszczenie tutejszej siedziby Templariuszy i tym samym oswobodzenie miasta spod ich władzy. Rzecz jasna, Ezio nie jest w stanie dokonać wszystkiego w pojedynkę – konieczne jest odbudowanie miejscowych szeregów bractwa i rekrutacja nowych członków spośród obywateli zainteresowanych walką o wolność.